用于牙周炎源性骨缺损修复的3D打印生物墨水

牙周病是被世界卫生组织认定为危害人类健康的三大疾病之一。恢复牙周炎引起的骨丧失是避免牙齿松动脱落的关键步骤之一。然而，由于生物功能材料的应用单一以及口腔炎症和细菌微环境的存在，目前临床上广泛应用的牙周骨再生材料或技术难以实现牙槽骨再生。南方医科大学口腔医院于光涛等人联合深圳湾实验室饶浪教授课题组设计开发了一种3D打印生物墨水用于牙周炎源性骨缺损修复，该生物墨水由EPLGMA为主体并装载干细胞和细胞囊泡用于发挥抗菌抗炎促成骨功能。相关研究成果以题为“3D-printed bioink loading with stem cells and cellular vesicles for periodontitis-derived bone defect repair"的文章发表在《Biofabrication》上。南方医科大学口腔医院博士研究生赵瑜越、深圳湾实验室博士后朱文祥为第一作者，南方医科大学口腔医院于光涛、容明灯、麻丹丹和深圳湾实验室饶浪教授为共同通讯作者。

图1. 仿生3D打印墨水的制备工艺及其对牙周炎源性骨缺损的生物学作用示意图

作者首先通过摩方精密microArch® S230（精度：2 μm）打印了以EPLGMA为主体的仿生模板，结合模板法和光引发聚合合成了EPLGMA@PDLSCs@MDCSs-MV(EPM)。具体步骤如下：首先，将GMA缓慢滴入EPL溶液中，得到EPLGMA，在蓝光(405 nm)照射后转化为交联水凝胶。然后，将乳牙牙周膜的PDLSCs和MDSCs膜囊泡(MDSCs- MV)加入EPLGMA中形成溶液生物墨水。通过扫描电镜观察冻干生物墨水的微观结构，我们可以清楚地看到网状多孔结构，这有利于促进PDLSCs的增 殖、迁移和营养物质或代谢物的运输，从而发挥作用（图2）。

图2. EPLGMA的特点。(a) EPLGMA制备工艺示意图。(b) EPLGMA状态:蓝光照射前(左)和照射后(右)。(c)冻干EPLGMA的扫描电镜。(d) EPL和EPLGMA的1H NMR谱。(e) EPLGMA的时间扫描流变分析。(f) EPLGMA的粘度。(g) EPLGMA的压应力-应变曲线。

随后，作者探究了仿生墨水的3D打印性能。作者利用Solidworks软件建立三维CAD模型，通过对于不同结构的模型进行打印，证明仿生墨水打印出的结构在大尺寸上仍能够保持一定的精准度。随后作者用激光共聚焦显微镜对打印形状内的细胞进行显色观察，结果显示细胞在3D打印仿生墨水中的形态下分布均匀，并且保持良好的活力（图3）。表明了EPM是一种高效、可行、个性化的打印生物墨水。

图3. 3D打印系统对EPLMA生物墨水进行个性化3D打印。

为了验证EPL天然的抗菌潜力，作者将生物墨水与牙龈卟啉单胞菌共培养两个小时，并将其涂布到血平板上进行观察。24小时后可见EPM组表现出良好的抗菌效果（图4）。

图4. EPM的抗菌性能。(a) EPM抗菌功能示意图。(b) PBS(对照)和EPM处理2 h后的牙龈卟啉单胞菌(P.g)的血平板培养照片。(c)不同组牙龈卟啉单胞菌数量的定量评价。(d) PBS(对照)和EPM处理后的牙龈卟啉单胞菌活/死染色。

控制炎症是牙周炎治疗过程中重要步骤。作者利用MDSCs在抗炎中发挥的作用，首先从荷瘤小鼠体内收集MDSCs，并提取MDSCs-MV，然后采用蛋白图谱分析了MDSCs-MV的蛋白组成。通过KEGG通路分析，结合免疫荧光实验结果，作者表明MDSCs-MV可以通过CD39/CD73-腺苷信号通路靶向抑制微环境中的T细胞从而发挥抗炎功能（图5）。

图5. MDSCs-MV的抗炎特性(a) MDSCs-MV生物学功能示意图。(b) Western blot检测MDSCs和MDSCs- mv的特征性膜蛋白标志物。(c) MDSCs-MV孵育后T细胞的代表性共聚焦图像。(d) CD3和MDSCs-MV荧光强度线扫描。(e)流式细胞术定量T细胞MDSCs-MV的荧光强度。(f) Elisa法检测转染MDSCs-MV或不转染MDSCs-MV后T细胞分泌腺苷的情况。(g)经MDSCs-MV或不经MDSCs-MV孵育后CD4+ T细胞CFSE稀释的典型流式细胞术图。(h)不同组CD4+ T细胞CFSE稀释度的定量分析。(i) CD8+ T细胞加或不加MDSCs-MV孵育后CFSE稀释后的典型流式细胞术图。(j)不同组CD8+ T细胞CFSE稀释度的定量分析。

最后，为了评估3D生物墨水的成骨能力，作者构建了SD大鼠颌骨骨缺损模型，并同期模拟炎症状态，然后根据骨缺损的面积以及深度，打印出合适的形状并进行了验证。经过3个月的治疗后，通过Mirco-CT以及免疫荧光实验结果，EPM@Pg组展示出了最佳的抗菌、抗炎以及促成骨效果 （图6）。

图6. EPM的体内骨再生效果。(a)生物墨水治疗人工牙周炎骨缺损小鼠模型的实验设计。(b)用不同生物墨水完成的3d打印。(c)生物墨水治疗牙周炎骨缺损的手术过程图片。(d)术后2、3个月不同治疗组下颌骨缺损区具有代表性的三维Micro-CT图像。(e) - (i) BV (f)、BV/TV (f)、Tb.N (g)和Tb.Th(h)的定量分析。

结论：作者利用EPLGMA加载PDLSCs和MDSCs-MV，制作了一种新型的、可定制的多功能3D打印模块，用于治疗牙周炎源性骨缺损。该EPM材料继承了EPL的天然抗菌特性，可以有效地杀灭牙周病细菌，并且在抗炎方面，其中的MDSCs-MV通过CD73/CD39/腺苷信号通路抑制T细胞。总之，EPM支架表现出良好的抗菌、抗炎和骨再生效果。与传统骨粉填充材料相比，3D打印仿生墨水材料具有更加优异的生物性能。